原理：

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗大鼠抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品和待测样本，经过孵育，样本中存在的抗原与固相抗体结合。洗涤去除未结合的物质后，加入生物素化的检测抗体孵育。洗涤去除未结合的生物素化的抗体，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin HRP)。洗涤后，加入信号增强剂孵育，洗涤去除未结合的物质后，再次加入Streptavidin HRP。洗涤后，加入显色底物TMB，避光显色。颜色反应的深浅与样本中TNFα的浓度成正比。加入终止液终止反应，在450nm波长（参考波长570-630nm）测定吸光度值。

组成：

试剂盒保存于2-8℃，有效期标注于标签上。只有恰当保存的试剂才是有保证的。如果试剂盒的组分需要再次使用，请确保上一次使用之后没有被污染。

检测步骤

1.样本采集与贮存

细胞培养上清

300×g离心10分钟去除沉淀物，即刻检测，或者分装，-20℃以下贮存。

血清样本

离心管收集血清。血样凝集30分钟后，1,000×g离心10分钟。吸取血清样本之后即刻检测，或者分装，-20℃以下贮存。

血浆样本

EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝收集血浆样本。1,000×g离心30分钟收集样本。即刻检测，或者分装，-20℃以下贮存。

本试剂盒可能适用于其它生物学样本。细胞培养上清、血清和血浆已经过验证。

注意：检测前，样本中可见的沉淀必须去除。不要使用严重溶血或高血脂的样本。样本应分装并贮存于-20℃，以避免IGF-1活性的丢失。如果在24小时内检测。样本可以存放在2-8℃。避免样本的反复冻融。在检测前，冷冻样本应缓慢地恢复至室温，轻柔地混匀。

2.样本准备

正常小鼠血清血浆样本需要1000倍稀释。推荐两步稀释。第一步，10μl样本+ 190μl 1×检测缓冲液。第二步，10μl第一步稀释的混合样本+490μl 1×检测缓冲液。

正常大鼠血清血浆样本需要4000倍稀释。推荐两步稀释。第一步，10μl样本+ 490μl 1×检测缓冲液。第二步，10μl第一步稀释的混合样本+790μl 1×检测缓冲液。

3.试剂准备

检测前请将所有的试剂、样本恢复至室温。

如果浓缩的试剂出现结晶，37℃温浴，直至结晶全部溶解。

1×洗液

吸取20×浓缩洗液50ml至1L的量筒，加蒸馏水至1,000ml，轻轻混匀，避免泡沫。转移至干净瓶内。2-25℃贮存，1×洗液可稳定保存30天。

1×检测缓冲液

吸取10×浓缩检测缓冲液15ml至250ml量筒，加蒸馏水至150ml，轻轻混匀，避免泡沫。2-8℃贮存，1×检测缓冲液可稳定保存30天。

检测抗体

稀释前充分混匀。根据标准品和待检样本的数量，用1×检测缓冲液按1：100稀释浓缩的检测抗体。

注意：请在30分钟内使用稀释后的检测抗体。

辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素

稀释前充分混匀。根据标准品和待检样本的数量，用1×检测缓冲液按1：100稀释浓缩的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

注意：请在30分钟内使用稀释后的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

样本稀释

如果样本需要稀释，请用试剂盒提供的1×检测缓冲液稀释血清/血浆样本，用细胞培养基稀释细胞培养上清。

IGF-1标准品

开盖前短暂离心，用蒸馏水重溶IGF-1标准品，重溶体积标注于IGF-1标准品的标签上。轻柔地涡旋震荡，确保充分混匀，重溶后标准品的浓度为2,000pg/ml。重溶后静置10 -30分钟。稀释前充分混匀。请使用聚丙烯管进行标准品稀释。

血清/血浆样本标准曲线的制备：

取230μl浓缩的IGF-1标准品，加入230μl1×检测缓冲液，作为标准曲线的最高浓度(1,000pg/ml)。在每一个试管中加入230μl1×检测缓冲液。使用高浓度标准品做1：1系列稀释。每次移液时，请确保充分混匀。以1×检测缓冲液作为标准曲线的零浓度。

细胞培养上清样本标准曲线的制备：

取230μl浓缩的IGF-1标准品，加入230μl细胞培养基，作为标准曲线的最高浓度(1,000pg/ml)。在每一个试管中加入230μl细胞培养基。使用高浓度标准品做1：1系列稀释。每次移液时，确保充分混匀。以细胞培养基作为标准曲线的零浓度。

4.检测步骤

检测之前请将所有的试剂、样本平衡至室温。

1) 准备好所有需要的试剂及工作浓度标准品。

2) 将不需要的板条拆卸下来，放回装有干燥剂的铝箔袋，重新封好封口。

3) 浸泡酶标板：加入300μl1×洗液静置浸泡30秒。为了获得理想的实验结果浸泡是必须的。弃掉洗液之后，在吸水纸上将微孔板拍干。洗板完成之后，请立即使用微孔板，不要让微孔板干燥。

4) 加标准品：标准品孔加入100μl2倍倍比稀释的标准品。空白孔加入100μl 1×检测缓冲液(血清/血浆样本)或培养基(细胞培养上清样本)。

5) 加加样本：血清/血浆：样本孔加入100μl预稀释样本。细胞培养上清：样本孔加入100μl细胞培养上清。(样本稀释请参考第6页“样本准备”)。保证步骤4、5连续加样，不要间断。加样过程在15分钟内完成。

6) 孵育：使用封板膜封板。300转/分钟振荡，室温孵育2小时。

7) 洗涤：弃掉液体，每孔加入300μl洗液洗板，洗涤6次。每次洗板，在吸水纸上拍干。为获得理想的实验性能，必须彻底移除残留液体。

8) 加检测抗体：每孔加入100μl稀释的检测抗体(1:100稀释)。使用封板膜封板。300转/分钟振荡，室温孵育1小时。

9) 洗涤：重复步骤7。

10) 加酶孵育：每孔加入100μl稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(1:100稀释)。使用新的封板膜封板。300转/分钟振荡，室温孵育45分钟。

11) 洗涤：重复步骤7。

12) 加底物显色：每孔加入100μl显色底物TMB，避光，室温孵育5-30分钟。

13) 加终止液：每孔加入100μl终止液。颜色由蓝色变为黄色。如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀，请轻轻叩击板框，充分混匀。

14) 检测读数：在30分钟之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定450nm最大吸收波长和570nm或630nm参考波长下的OD值。校准后的OD值为450nm的测定值减去570nm或630nm的测定值。仅使用450nm测定会导致OD值偏高，并且准确度降低。

注意事项

1) 所有的化学试剂理应被认为具有潜在危害。

2) 推荐只有经过良好实验室培训的工作人员方可操作本试剂盒。操作时请佩戴合适的防护设施，例如白大衣、乳胶手套、安全眼镜等。

3) 请避免试剂接触皮肤和眼睛。如不慎接触，请立即用大量清水清洗。

4) 试剂盒中的终止液为酸性溶液，在使用终止液时，请佩戴防护服，及防护眼睛、手及面部的设施。

5) 本试剂盒用于科学研究，不能用于诊断治疗。

6) 请不要使用其他批号或其他来源的试剂替代本试剂盒中的试剂。

7) 请不要使用过期的试剂。

8) 在试剂盒的贮存或孵育过程请避免强光照射。

9) 在操作试剂盒或处理样本的区域请不要饮食。

10) 不要让试剂或样本接触皮肤和粘膜。

11) 在操作试剂盒或处理样本时请佩戴乳胶或一次性手套。

12) 显色底物避免与氧化试剂和金属接触。

13) 避免气溶胶的产生。

14) 为了避免微生物的污染，以及试剂与样本间的交叉污染，请使用一次性枪头。

15) 使用干净的容器配制试剂。

16) 暴露于酸性环境会抑制结合。

17) 试剂的准备必须使用蒸馏水或去离子水。

18) 显色底物在使用之前必须平衡至室温。

19) 样本可能含有传染性病原体，处理样本和可能的污染材料的首选方法是121.5℃，最少1小时。

20) 液体废弃物的处理。不含酸的液体废弃物，加入1.0%的次氯酸钠，浸泡30分钟。含酸的液体废弃物，请先中和，再加入次氯酸钠。