过氧化氢酶 CAT 酶活性检测试剂盒（比色法）E2030

产品简介

过氧化氢酶检测试剂盒（Catalase Assay Kit）是一种特异灵敏的检测过氧化氢酶（Catalase）酶活力的试剂盒。Catalase 是一种广泛存在于需氧细胞内的抗氧化酶，通过催化过氧化氢（H2O2）分解为氧气和水，降低生理和病理状态下产生的活性氧对细胞的损伤。本试剂盒利用 Catalase 催化 H2O2 分解，然后利用过氧化物酶（Peroxidase）催化剩余 H2O2 与 OxiRed探针反应生成可以通过比色法或荧光法检测到的产物，从而定量分析 Catalase 酶活力。本试剂盒通过比色法（OD570nm）检测 Catalase 的线性范围为 0.001-0.01U/ml，灵敏度≤0.001U/ml；通过荧光法（ex535nm-em587nm）检测 Catalase 的线性范围为 0.0001-0.001U/ml，灵敏度≤0.0001U/ml。本试剂盒能够检测细胞培养上清、细胞裂解上清、组织裂解上清、血浆和血清中的 Catalase 酶活力。试剂盒组成

组份名称

Lysis Buffer    50 ml/瓶

Catalase Assay Buffer    25 ml/瓶

H2O2 Solution (0.88M)    0.5 ml/管

OxiRed Solution    60 μl/管

Peroxidase    60 μl/管

Catalase   60 μl/管

需要而未提供的试剂及器材

1. 超纯水

2. 系列可调节量程移液器及吸头

3. 离心管、透明（比色法）或黑色（荧光法）96 孔板

4. 多功能酶标仪

储存条件

-20℃储存，有效期 12 个月。

注意事项

1. 初次使用试剂盒时，小体积液体试剂请适当离心后使用。

2. 实验过程中，除裂解液、检测缓冲液和过氧化氢溶液外，其它试剂请置于冰上。

3. 严格控制反应的温度和反应时间，样品中酶活力过低时，可适当延长反应时间。

4. H2O2标准曲线和 Catalase 对照只需测定 1 次即可。

5. 本产品仅限专业人员用于科学研究，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。

测定前准备

1. 样品的准备

1.1 细胞培养上清的准备：将需要测定的细胞接种到培养板中，经过干预因素处理后，直接吸取细胞上清，如果是悬浮细胞，4℃、300g 离心 5 分钟，收集上清。

1.2 细胞裂解上清的准备：将需要测定的细胞(1×106-1×107)收集到 2ml 的离心管中，4℃、300g 离心 5 分钟，弃去上清，然后加入 200μl 的 Lysis Buffer，冰浴裂解 30min，4℃、10000g 离心 10 分钟，收集上清。

1.3 组织裂解上清的准备：将需要测定的组织(20-50mg)收集到玻璃匀浆器或自动匀浆管中，然后加入0.5ml 的 Lysis Buffer，匀浆 1min，4℃、10000g 离心 10 分钟，收集上清。

1.4 血浆样品的准备：取新鲜抗凝血液，4℃、1000g 离心 10 分钟，上清为血浆。

1.5 血清样品的准备：取新鲜血液，室温凝固 30min，4℃、1000g 离心 10 分钟，上清为血清。

2. 试剂盒的准备

Catalase 检测工作液的配制：根据待测样品数参考下表配制适量的 Catalase 检测工作液，表中试剂按比例混合后即为 Catalase 检测工作液。

1 个样品

10 个样品

50 个样品

Catalase Assay Buffer

49 μl

0.49 ml

2.45 ml

OxiRed Solution

0.5 μl

5 μl

25 μl

Peroxidase

0.5 μl

20 μl

25 μl

3. 标准品的准备

比色法标准品的准备：在 1.5ml 离心管中，加入 870μl Catalase Assay Buffer，取 10μl 的 0.88M 浓度H2O2 标准品加入离心管中配制 10mM 浓度 H2O2 标准品；然后取另一 1.5ml 离心管，加入 980μl CatalaseAssay Buffer，取 20μl 的 10mM 浓度 H2O2 标准品加入离心管中配制 200μM 浓度 H2O2 标准品；另外 6 根1.5ml 离心管，分别加入 500μl Catalase Assay Buffer，再吸取 500μl 的 200μM 浓度 H2O2 标准品依次倍倍稀释为 100、50、25、12.5、6.25、3.12μM 浓度。荧光法标准品的准备：在 1.5ml 离心管中，加入 870μl Catalase Assay Buffer，取 10μl 的 0.88M 浓度H2O2 标准品加入离心管中配制 10mM 浓度 H2O2 标准品；然后取另一 1.5ml 离心管，加入 990μl CatalaseAssay Buffer，取 10μl 的 10mM 浓度 H2O2 标准品加入离心管中配制 100μM 浓度 H2O2 标准品；再取另一1.5ml 离心管，加入 800μl Catalase Assay Buffer，取 200μl 的 100μM 浓度 H2O2 标准品加入离心管中配制20μM 浓度 H2O2 标准品；另外 6 根 1.5 ml 离心管，分别加入 500μl Catalase Assay Buffer，再吸取 500μl 的20μM 浓度 H2O2 标准品依次倍倍稀释为 10、5、2.5、1.25、0.625、0.312μM 浓度。

测定方法

1. H2O2 标准曲线测定：利用上述系列浓度 H2O2 标准品，参考下表，测定 H2O2 标准曲线。

空白对照

标准品

Lysis Buffer

50 μl

50 μl

Catalase Assay Buffer

50 μl

─

H2O2 标准品

─

50 μl

Catalase 检测工作液

50 μl

50 μl

25℃孵育

1 min

1 min

注：在上述反应体系中，比色法测定中 H2O2标准品加入 96 孔板中的量分别为 10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156 nmol。荧光法测定中 H2O2标准品加入 96 孔板中的量分别为 1、0.5、0.25、0.125、0.062、0.031nmol。

2.

样品测定：参考下表，使用透明（比色法）或黑色（荧光法）96 孔板，首先加入 Lysis Buffer 、Catalase 对照或样品，然后加入 H2O2Solution，25℃反应 10 分钟，最后加入 Catalase 检测工作液，25℃反应 1 分钟。

空白对照孔

H2O2 对照孔

Catalase 对照孔

样品孔

Lysis Buffer

50 μl

50 μl

─

─

Catalase 对照

─

─

50 μl

─

样品

─

─

─

50 μl

Catalase Assay Buffer

50 μl

─

─

─

H2O2 Solution

─

50 μl

50 μl

50 μl

25℃孵育

10 min

10 min

10 min

10 min

Catalase 检测工作液

50 μl

50 μl

50 μl

50 μl

25℃孵育

1 min

1 min

1 min

1 min

注：比色法中加入 H2O2 Solution 浓度为 200μM，荧光法中加入 H2O2 Solution 浓度为 20μM；对于Catalase 对照孔，比色法测定中，利用 Lysis Buffer 将试剂盒中 Catalase 原液稀释 10 倍，然后加入 Catalase对照孔 50μl；荧光法测定中，利用 Lysis Buffer 将试剂盒中 Catalase 原液稀释 100 倍，然后加入 Catalase

对照孔 50μl。

3. 待反应完成后，比色法利用酶标仪测定 570nm 波长的吸光度，荧光法测定 ex535nm-em587nm 的荧光值，当样品中 Catalase 酶活力偏低时，请选择荧光法测定，另外可以适当延长加入 H2O2 Solution 后Catalase 催化反应的时间。

数据处理

利用 H2O2 标准品的量为横坐标，吸光度值或荧光值为纵坐标制作标准曲线，然后利用样品测定中吸光度值或荧光值，计算样品中 Catalase 催化分解 H2O2的量。根据 Catalase 酶活力定义：在 pH7.0、25℃条件下每分钟催化 1μmol H2O2 分解的 Catalase 酶活力为 1U，计算样品中 Catalase 酶活力。