Caspase-8酶活性测定试剂盒 C1118

描述：Caspase是参与细胞凋亡过程的蛋白酶家族，包含10多个成员。Caspase-8也称FLICE、MACH或Mch5，通常以酶原的形式存在，凋亡时被激活，被认为是细胞凋亡转导过程的上游caspase。在Fas-receptor和TNFR-1介导的凋亡过程中caspase-8被激活形成二聚体，进而激活下游caspase-4,6,9,10。

测定原理基于Caspase-8特异水解多肽底物Ile-Glu-Thr-Asp-p-nitroanilide (IETD-pNA)，释放的游离硝基苯胺pNA在405 nm有最大吸光度。采用可见光光度比色法测定pNA而得到Caspase活性。适用于检测哺乳动物组织、细胞Caspase-8活性。

组成 (所示为100次检测, 50次检测试剂量减半)

1. 裂解缓冲液20ml, 4 ºC

2. 反应缓冲液10ml, 4 ºC

3. 底物 0.5ml, -20 ºC避光

4. 10mM pNA标准品0.2ml, -20 ºC避光

试剂常温运输，到达后按要求储存，1年内稳定。

所需仪器：可见光分光光度计配100μl比色杯，或酶标仪。最佳波长405nm，也可测OD400~450nm但灵敏度略降。

组织细胞准备：

Caspase活性测定值低，最常见原因是未发生凋亡或细胞量太少，其次是观测时间点不恰当。诱导凋亡时，并非剂量越大时间越长Caspase活性就越高。可设置不同剂量和时间点如0、2、4、8、16、24小时，以检测最佳的观察点。通常2×10⁷细胞或2mg组织裂解于1ml可产生1~3mg/ml蛋白。初次测定时，单个测定反应可加~200μg蛋白物对应于2×10⁶细胞或2个孔的6孔板细胞。最少，单个测定反应需加20μg蛋白对应于2×10⁵个细胞或2个孔的12孔板细胞。勿用丝氨酸蛋白酶抑制剂如E-64和leupeptin以免抑制Caspase活性。

1. (1)细胞裂解：1000g 5分钟收集细胞，吸尽上清。每2~10×10⁶细胞加50~100µl裂解液震荡裂解，冰浴10分钟，再次震荡。(2)组织裂解：3~10mg组织加100 µl裂解液放入小型玻璃匀浆器，上下匀浆30次。转移匀浆液于离心管。

2. 4 ºC 12,000g 10分钟，取上清测定，或-70 ºC保存。

3. 蛋白定量：用Bradford法测定蛋白浓度。裂解液含还原剂不宜采用BCA法。应使蛋白浓度达到1-3mg/ml，相当于每10 μl待测样品含10-30μg蛋白，否则应增加细胞用量。

测定pNA标准曲线：

1. 用反应缓冲液稀释10mM pNA标准品为200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125μM。设置不加pNA的零管。

2. 每一浓度取100μl加入96孔板或100μl比色杯，测定405nm吸光度OD值。

3. 每一浓度标准管OD405值为x轴，对应的pNA浓度为y轴，用Excel制作pNA浓度对OD405值的标准曲线。

样品测定操作：

1. 按下表设置96孔板反应体系。底物最后加入以使各管反应起始时间相同。设置不加样品的空白对照管。酶活力不足或过高，可增加或减少样品。

2. 盖紧96孔板盖子并用封口膜密封。37 ºC反应2小时，肉眼可见颜色变黄时的OD405值约为0.2，此时即可测定。颜色变化不明显可延长反应或过夜，但酶活性较强时，孵育时间过长将导致反应失去线性关系。

3. 样品管OD405减去空白对照OD405，为样品Caspase水解底物产生的pNA吸光度。根据标准曲线计算其含量，并以蛋白浓度校正之。

4. 测得的Caspase酶活性表示方法有两种。(1) Caspase活性增加的百分比：100% × 实验处理组OD / 实验对照组OD，简单而可靠。(2)样品Caspase酶活力单位/mg protein，精确但计算较复杂，参见说明。

反应体系参考表 (允许适当调整样品加样量)

说明：

1. Caspase酶活力单位定义：参考Chemicon公司One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37 ºC under saturated substrate concentrations。即当底物饱和时,一个Caspase酶活力单位定义为37 ºC 1小时水解pNA底物，产生1nmol游离pNA。根据pNA标准曲线和样品OD值，可计算出Caspase酶活力单位。

2. 除了处理组外，可设置阳性凋亡诱导剂组，阴性实验对照可包括不具有凋亡诱导作用的试剂(如果能得到)处理组、溶剂对照组、或凋亡诱导零时间点。

参考文献：

1. Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J. 326, 1-16 (1997).

2. Porter AG and Janicke RU. Emerging role of caspase-3 in apoptosis. Cell Death Differ. 6, 99-104 (1999).